Tecnologías bioelectroanalíticas para determinar metilaciones a nivel global y regional en ácidos nucleicos

Breve descripción

Las tecnologías desarrolladas permiten la determinación individual o simultánea de las principales bases metiladas en ADN (5-metilcitosina, 5-mC; 5-hidroximetilcitosina, 5-hmC; 5-formilcitosina, 5-fC; y 5-carboxil-citosina, 5-caC) y ARN (N6-metiladenosina, m6A), tanto a nivel global como regional, de forma rápida, fiable y sencilla.

¿Cómo funciona?

Las tecnologías se basan en la implementación de formatos de afinidad y marcaje enzimático con la enzima peroxidasa de rábano (HRP) sobre micropartículas magnéticas (MBs) comerciales y en la transducción amperométrica sobre electrodos impresos desechables.

Para la determinación a nivel regional, el ADN o ARN metilado diana se captura selectivamente sobre MBs modificadas con una sonda sintética de ADN biotinilada y se detecta empleando un anticuerpo selectivo a la base metilada diana que se marca enzimáticamente con HRP (Proteína A-polyHRP80).

Para la determinación a nivel global, se emplean formatos de inmunoensayo de tipo competitivo directo sobre los inmunoconjugados en los que el ADN o ARN diana metilado compite por los limitados sitios de unión de los anticuerpos inmovilizados sobre las MBs con un oligómero de ADN o ARN biotinilado sintético que porta una única base metilada y que se marca con la enzima HRP (conjugado de estreptavidina-HRP).

En todos los casos, las MBs modificadas se capturan magnéticamente sobre la superficie de electrodos (o arrays de electrodos) desechables y se realiza la transducción amperométrica empleando el sistema HRP/hidroquinona (HQ)/H₂O₂ obteniéndose una variación de corriente catódica que puede relacionarse con la concentración de la base metilada diana.

¿Qué problema resuelve?

Los resultados obtenidos confirman unas excelentes prestaciones para realizar determinaciones fiables en células y biopsias humanas de distinta naturaleza (sólidas y líquidas). Se ha confirmado, asimismo, el prometedor potencial de estas bioplataformas para:

• discriminar entre individuos sanos y afectados por cáncer mediante la determinación del nivel global de 5-mC y 5-hmC en ADN genómico extraído de tejidos o 5-mC a nivel regional directamente en muestras de suero;
• evaluar las capacidades metastásicas de las células cancerosas e identificar tejidos tumorales y su estadio canceroso analizando simultáneamente el contenido total de un miRNA y su fracción metilada (Figura 1);
• confirmar la completa resección del tumor tras la cirugía e identificar diferentes tipos de cáncer interrogando a nivel global 5mC, 5-hmC, 5-fC y 5-caC en ADN genómico de tejidos;
• caracterizar la agresividad de las células tumorales detectando m6A a nivel global en extractos de ARN total sin necesidad de enriquecimiento o fragmentación.

En las determinaciones en células y tejidos humanos, la cantidad de ADN genómico o de ARN celular empleado por determinación está comprendida entre 10 y 100 ng.

¿Qué productos futuros resultarán?

La incorporación a la rutina clínica de estas tecnologías bioelectroanalíticas, que proporcionan resultados consistentes con los suministrados por las convencionales (RT-PCR), conllevaría ventajas importantes en términos de sencillez, rapidez, coste, portabilidad y multiplexado, fiabilidad para el diagnóstico temprano y el pronóstico de enfermedades prevalentes y mejora de la eficiencia de la terapia y de la supervivencia y calidad de vida de los pacientes.

Ventajas competitivas frente a otras investigaciones

Entre las ventajas competitivas de las tecnologías desarrolladas destacan:

• Fácilmente trasladables a la determinación individual o múltiple de otras epimarcas de interés.
• Implementación sencilla en dispositivos de diagnóstico en el punto de atención (POC).
• Sensibilidad a nivel de una única base sin necesidad de emplear etapas de amplificación de ácidos nucleicos.
• Proporcionar resultados cuantitativos en tiempos inferiores a 2 h y con coste muy asequible (< 2 € / determinación).

¿Dónde se ha desarrollado?

Estas bioplataformas se han desarrollado en el Grupo de Electroanálisis y (Bio)sensores Electroquímicos de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Complutense de Madrid (Grupo GEBE-UCM, Referencia 910319) y en colaboración con investigadores y clínicos del Instituto de Salud Carlos III (Grupo ProteoFun-ISCIII).

Y además...

Página web con información adicional: https://gebeucm.wordpress.com/.