Diagnóstico de infecciones periodontales mediante técnicas inmunoquímicas Elisa y Luminex

Mariano Sanz Alonso |  Contacto | Departamento: Estomatología III | Facultad: Odontología

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Breve descripción

Estudio de marcadores bioquímicos relacionados con las enfermedades odontológicas. La técnica de ELISA o ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (en inglés enzyme-linked immunosorbent assay), permite la identificación de antígenos o anticuerpos en muestras tanto de saliva como de fluido crevicular gingival o sangre, que ayudan a determinar el estado inmunológico del individuo y por tanto estudiar el grado de desarrollo de la enfermedad. Esta tecnología permite estudiar un analito en cada ensayo, muy útil por tanto, cuando el número de parámetros a estudiar no es elevado. Si se precisa un estudio más amplio, es posible utilizar la técnica de Luminex. El Luminex® 100/200™, es un analizador flexible, basado en los principios de la citometría de flujo que posibilita el análisis simultáneo de hasta 100 analitos diferentes en el mismo volumen de muestra. Esta técnica permite además realizar bioensayos no solo inmunoquímicos sino ensayos enzimáticos, de receptor-ligando y ensayos con ácidos nucleicos.

Tanto la técnica de ELISA como la de LUMINEX son muy utilizadas en estudios dentro del campo de la biología, la bioquímica o la medicina. Estas dos técnicas han demostrado, así mismo, su importancia en el área de la odontología, siendo imprescindibles para estudiar el tipo de respuesta inmune desencadenada por las diferentes infecciones bacterianas y conocer los mecanismos implicados en los procesos de remodelación ósea.

¿Cómo funciona?

La técnica de ELISA está basada uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, haciendo que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al reaccionar la enzima producirá un color observable o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

En la técnica de Luminex® 100/200™ los reactivos (anticuerpos, oligonucleótidos, sustratos, etc.) están anclados a la superficie de microesferas de poliestireno. El espectro de emisión de cada una de estas microesferas es único, lo que posibilita la identificación simultánea de todas ellas y por tanto, de la reacción o ensayo que se está llevando a cabo en la superficie de cada una de ellas al mismo tiempo. Las microesferas están marcadas con dos fluoróforos de forma que se establece un ratio de ambos en cada una de ellas. Así aparecerá la primera de las microesferas con un 100% del primer fluoróforo y 0% del segundo, la 2ª microesfera con 99% del primer fluoróforo y un 1% del segundo y así sucesivamente hasta completar 100 microesferas perfectamente identificables dentro del mismo tubo de reacción.

Tras las diferentes incubaciones, donde se habrá unido otro fluoróforo a los reactivos específicos de los ensayos (anticuerpos, oligonucleótidos, sustratos, etc.) anclados en la superficie de las esferas, la placa en la que se realiza en ensayo será leída en el sistema Luminex® 100/200™ donde las microesferas pasan por una corriente de flujo. Cada una de ellas es clasificada de acuerdo a su marcaje fluorescente interno identificando el parámetro de estudio.

Además de esto, el lúminex 100 System escanea cada una de las microesferas la cantidad del otro fluoroforo determinando la concentración del parámetro de estudio en la muestra Estas esferas son partículas de poliestireno que se han sometido a la acción del crosslinker durante su polimerización para conseguir una elevada estabilidad térmica y física. Para asegurar la estabilidad de estas microesferas es esencial protegerlas de la luz y de elevadas temperaturas existen diferentes tipos de reactivos para su uso con el sistema lúminex 100 IS. Hay desde microesferas de calibración con ratios conocidas de fluoróforos hasta microesferas de control, pasando por aquellas que presentan en su superficie desde grupos carboxilo hasta Avidina para la unión covalente de diferentes biomoléculas y ligandos biotinilados respectivamente, para que cada usuario pueda hibridar lo que necesite sobre la superficie de las microesferas.

Las muestras de fluido crevicular gingival habitualmente son recogidas utilizando un periopaper por localización, que se mantendrá alrededor de 30 segundos dentro del surco gingival facilitando la toma de la muestra por capilaridad. Las muestras manchadas con sangre deben ser descartadas Ya que pueden producirse interferencias en el desarrollo del inmunoensayo. Una vez recogidas, han de conservarse a -80ºC hasta su posterior análisis. Se utilizará un buffer tampón especial para la extracción de la muestra desde el periopaper previamente a la realización del análisis. Si las muestras que se desea estudiar son de saliva, deberá estimularse la secreción de la misma y se recogerá en viales de capacidad variable en función del estudio. Estas muestras serán centrifugadas y se conservará la parte precipitada a -80ºC hasta su análisis por la técnica de inmunoensayo escogida.

Las muestras de sangre, habitualmente son recogidas en tubos especialmente preparados para ello, que variarán en función de los parámetros que quieran ser estudiados. Estos viales serán centrifugados para poder recoger el plasma o el suero que se congelará a -80ºC hasta su posterior análisis. La congelación de las muestras permite la recopilación de mismas para ser analizadas al mismo tiempo, favoreciendo que todas sean estudiadas bajo las mismas condiciones experimentales.

¿Qué problema resuelve?

Permite analizar varios biomarcadores, hasta 100 diferentes en cantidades de muestra muy pequeña 50 últimos por lo que se hace especialmente interesante para muestras de fluido crevicular gingival del que se puede recoger poca muestra.

¿Qué productos futuros resultarán?

Facilitar el diagnóstico y el efecto de un tratamiento en muestras mínimamente invasivas como fluido crevicular gingival o saliva en 24 horas obteniendo resultados precisos y que permiten reflejar una visión amplia de lo que está ocurriendo analizando a la vez por ejemplo marcadores pro y antiinflamatorios.

Ventajas competitivas frente a otras investigaciones

Se trata de dos técnicas de alta precisión que pueden ser útiles en el diagnóstico y tratamiento de ciertas periodontitis y enfermedades sistémicas relacionadas. Entre los beneficios del uso de estas técnicas cabría destacar:

• Volumen de la muestra. Si los volúmenes de muestra tomados son elevados cualquiera de las dos técnicas puede ser válida. En caso de que el volumen de muestra sea limitada como por ejemplo muestras de fluido cerebroespinal, líquido sinovial, lágrimas, suero de ratón, etc, el sistema Luminex® 100/200™ permite el análisis de varios parámetros empleando un volumen de muestra muy pequeño.
• Tiempo de análisis: El tiempo total es el mismo para las dos técnicas si se analiza un solo parámetro. En caso de querer analizar varios parámetros el sistema Luminex permite ahorrar gran cantidad de tiempo ya que los analiza todos al mismo tiempo.

¿Dónde se ha desarrollado?

Estas técnicas han sido desarrolladas en la Sección de Periodoncia del departamento de Estomatología III de la Facultad de Odontología. El laboratorio de Investigación participa en proyectos relacionados con el estudio de marcadores inmunológicos con resultados satisfactorios. Además, representa una ayuda muy útil para el diagnóstico y tratamiento de los pacientes atendidos en el Máster de Periodoncia de la misma Facultad. Se ofrece a los investigadores ayuda técnica de personal altamente cualificado y asesoramiento en el análisis de los resultados.

Y además...

Con estas tecnologías se pueden aportar ayudas en investigación y en odontología clínica en varios sentidos:

• Añadir el análisis de variables inmunológicas en investigaciones dentro del campo de la odontología.
• Ayudar en el diagnóstico y tratamiento de los pacientes a la clínica odontológica, mediante la obtención de consejo basado en el análisis de la respuesta y estado inmunológico de los pacientes.
• Ayudar en la investigación de los mecanismos de remodelación ósea implicados en el desarrollo de la periodontitis a través de estudios “in vitro”.
• Ayudar en la investigación de otras enfermedades sistémicas relacionadas con el desarrollo de patologías orales.