PROCEDIMIENTO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE NEOSPORA CANINUM EN MUESTRAS DE SEMEN BOVINO

(A) Curva estándar para la cuantificación de N. caninum construida con diluciones decimales seriadas de ADN extraído de taquizoítos de cultivo celular y (B) Curva estándar para la cuantificación del ADN del hospedador construida con diluciones 1:5 seriadas de ADN genómico extraído del hospedador

RESUMEN

La presencia de N. caninum en muestras de semen bovino se cuantifica mediante una PCR cuantitativa en tiempo real, la cual utiliza el sistema SYBR Green I. Para la extracción del ADN del parásito de semen, se separa el fluido seminal de la fracción celular y se extrae el ADN de cada una de las fracciones utilizando una prueba comercial. Si es semen congelado con diluyente, la muestra se pasa a través de una columna de cromatografía de Sephacryl S-400 y el ADN se precipita con isopropanol y glicógeno. La cuantificación de N. caninum se realiza mediante interpolación del Ct (ciclo umbral: ciclo en el que una muestra es considera positiva) sobre una curva estándar construida con concentraciones conocidas de ADN del parásito frente a sus respectivos Ct. Para la cuantificación del ADN del hospedador se realiza con otra curva estándar con concentraciones conocidas de ADN genómico. La viabilidad del parásito se confirma mediante bioensayo, inoculando a ratones BALBc nu/nu la fracción celular de las muestras de semen bovino. La aparición de síntomas compatibles con la infección y/o la cuantificación del ADN del parásito por PCR cuantitativa en muestras de encéfalo demuestra la viabilidad del parásito en la muestra seminal.

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere a un procedimiento para la cuantificación de N. caninum en muestras de semen. De forma más concreta, la invención se refiere a la normalización y aplicación de la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real para la cuantificación del ADN del parásito N. caninum en muestras de semen bovino fresco o congelado. Este hecho posee valiosas aplicaciones, particularmente en la especie bovina, donde la inseminación artificial es una práctica habitual y la utilización de técnicas diagnósticas sensibles y específicas se hace necesaria a la hora de determinar el estado sanitario de los sementales bovinos, especialmente en centros de inseminación artificial y en explotaciones en extensivo, donde la monta natural tiene gran importancia.

INVENTORES

Luis Miguel Ortega Mora
Esther Collantes Fernández
Javier Regidor Cerrillo
Ignacio Ferre Pérez

TITULARES

Universidad Complutense de Madrid

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