Complutecno: Biotecnología / Tecnología de Alimentos

Determinación rápida de contaminación fúngica en alimentos

Descripción:

Se presenta un método genético para la detección rápida de Alternaria alternata como marcador de calidad y bioseguridad de vegetales frescos y procesados. La presencia de este moho micotoxigénico y alterante en productos elaborados (zumos, conservas, etc.) indica la utilización de materias primas deterioradas y la posible presencia de metabolitos tóxicos. Disponer de técnicas rápidas y específicas para su detección permitirá a las industrias mejorar el control de proveedores y la seguridad de los productos comercializados.

Fig. 1: Visualización mediante electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación obtenidos a partir del ADN de diversas especies de mohos, levaduras,  bacterias, plantas y especies animales.

(A): Se observa una única banda de amplificación de 195 pb en todas las especies de Alternaria analizadas, que incluyen (3-5) Alternaria alternata, (6) A. tennusima, (7) A. gaisen , (8) A. dauci , (9) A. infectoria, (10) A. longipes, (11) A. citri, (12) A. radicina, (13) A. porri, (14) A. solani y (15) A. arborescens. (B): Sólo aparece banda de amplificación en la cepa utilizada como control, A. alternata (3), pero no hay amplificación en los mohos, levaduras, bacterias, plantas ni animales analizados, que incluyen (4) Rh. stolonifer, (5) P. expansum, (6) F. oxysporum, (7) A. alutaceus, (8) Sacharomyces cerevisiae, (9) E. coli, (10) Cacahuete, (11) Nuez, (12) Cabra, (13) Merluza y (14) Pollo (G. gallus). (1) corresponde al marcador de tamaño molecular 100 bp ladder. (2) es el control negativo, que no incluye ADN en la reacción de amplificación.

¿Cómo funciona?:

La presencia de micotoxinas producidas por Alternaria en los alimentos es preocupante, especialmente en frutas y hortalizas frescas en las que A. alternata constituye la principal causa de alteración fúngica. La detección de cada una de las micotoxinas producidas por A. alternata en los alimentos no resulta práctica ni realista, puesto que el elevado coste económico resultaría inviable. Una aproximación novedosa, que permite estimar la posible presencia de micotoxinas en materias primas o productos elaborados y que, además, constituye un índice de calidad de materias primas, consiste en la detección y enumeración rápida de las formas viables y no viables de Alternaria alternata en estas matrices, empleando métodos genéticos.

El grupo de investigación sobre "Desarrollo de metodologías avanzadas de trazabilidad, detección de microorganismos en los alimentos y bioseguridad de los alimentos" ha identificado un marcador genético específico de Alternaria y ha diseñado cebadores para su amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de los cebadores diseñados están basadas en una región de 195 pb del gen que codifica el principal alergeno de Alternaria alternata, Alt a 1, y amplifican específicamente el ADN de las especies de Alternaria, pero no el de otros mohos, levaduras, bacterias o especies vegetales ni animales que puedan encontrarse en el alimento analizado.

Los cebadores diseñados pueden utilizarse en una técnica de PCR clásica, para la detección cualitativa de Alternaria a partir del ADN extraído de un alimento contaminado. Asimismo, a partir del ARN total extraído del alimento, permiten detectar células viables de Alternaria, mediante transcripción inversa seguida de PCR (RT-PCR). Los cebadores diseñados pueden emplearse además para el desarrollo de técnicas cuantitativas de PCR (como PCR-ELISA y PCR cuantitativo en tiempo real y RT-PCR en tiempo real), mediante la utilización de oligonucleótidos marcados y el diseño de sondas marcadas que hibriden en la región amplificada.

Una vez que se dispone de cebadores específicos de Alternaria el equipo investigador está llevando a cabo el estudio de la sensibilidad de las técnicas de PCR y RT-PCR y de la posible correlación entre la detección de Alternaria por estas técnicas y la presencia de metabolitos tóxicos en el sustrato analizado.

Fig.2: Visualización mediante electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación obtenidos por RT-PCR a partir del ARN de diversas especies fúngicas: (4) Control negativo RT-PCR, sin ARN; (5-6)  A. alternata; (7) A. tennuisima; (8-9) P. expansum; (10) F. oxysporum. (1) Marcador de tamaño molecular 100 bp ladder; (2) Control negativo de PCR, que no incluye ADN en la reacción de amplificación; (3) control positivo de PCR con ADN A. Alternata. Se observa la banda de amplificación de 125 pb en las muestras de ARN de Alternaria sp., pero no en otros géneros fúngicos. Se aprecia la diferencia de tamaño entre la banda amplificada a partir de ADN (195 pb) y de ARN (125 pb) de Alternaria.

Ventajas:

La utilización de materias primas contaminadas con Alternaria alernata para la elaboración de zumos, compotas y otros alimentos implica un peligro para la salud de los consumidores por la posible presencia de micotoxinas en los productos finales. La detección por HPLC de cada una de las micotoxinas producidas por Alternaria alternata no resulta práctica ni económicamente viable. Esta tecnología ofrece la detección y enumeración rápida de Alternaria alternata por métodos genéticos, como método indirecto para estimar la posible presencia de micotoxinas en materias primas o productos elaborados.

¿Dónde se ha desarrollado?:

El grupo investigador sobre "Desarrollo de metodologías avanzadas de trazabilidad, detección de microorganismos en los alimentos y bioseguridad de los alimentos", que ha desarrollado esta tecnología, pertenece al Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Veterinaria de la UCM. En los últimos años, el equipo ha desarrollado varias líneas de investigación que pretenden la utilización de técnicas inmunológicas y genéticas para la detección de diversos componentes de los alimentos, así como para la identificación y enumeración de microorganismos. La financiación de los proyectos de investigación realizados procede principalmente de convocatorias públicas, tanto en Programas Nacionales, subvencionadas por los Ministerios de Ciencia y Tecnología y Agricultura, Pesca y Alimentación, como en Programas Regionales subvencionados por la Comunidad de Madrid.

[más información sobre el departamento y el grupo de investigación]

Y además:

El grupo de investigación busca empresas de agroalimentación o biotecnología interesadas en completar el desarrollo de esta tecnología para fabricar un kit para la aplicación de esta técnica, o bien laboratorios privados u oficiales que quieran realizar análisis de calidad y seguridad en los alimentos.