Complutecno: Biotecnología

PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE PROTEÍNAS

Descripción:

Fig. 1: Estructura tridimensional del alergeno nIb de
colza, expresado en Pichia pastoris

Expresión biológica en sistemas heterólogos de DNAs que codifican proteínas naturales. Aislamiento y caracterización de las proteínas recombinantes.

¿Cómo funciona?:

Fig. 2: Producción alternativa de proteína natural y recombinante.

Se trata de aislar el RNA mensajero que codifica para una proteína concreta y obtener su correspondiente DNA complementario (cDNA). Este cDNA, previamente amplificado por PCR, se inserta en un vector génico que, replicado en una célula huesped, sirve de vehículo de expresión para la producción de una molécula recombinante. Una vez transformadas con el vector las células del huésped (en general bacterias -Escherichia coli-, o levaduras -Pichia pastoris-), el cultivo se hace crecer hasta que alcanza unos niveles de producción adecuados de la proteína recombinante.

En ocasiones, para facilitar las distintas etapas del proceso, la inducción y posterior aislamiento, es conveniente expresar un DNA que contenga enlazados el DNA de la proteína objetivo junto con el codificante para otra cadena polipeptídica, que puede ser la de una proteína completa o bien un fragmento peptídico. En ese caso, se produce una proteína de fusión. Posteriormente, la proteína así producida debe ser purificada hasta homogeneidad, para lo cual se hace uso de sus propiedades químico-físicas, peso molecular, solubilidad, carga, etc.

Para que la proteína recombinante sustituya eficazmente a la proteína obtenida de la fuente biológica natural, es esencial comprobar que sus propiedades moleculares son equivalentes. Por ese motivo, la caracterización estructural y funcional de la proteína recombinante es una etapa crítica a la hora de valorar el sistema de expresión utilizado.

Ventajas:

Fig. 3: Metodología para la clonación de proteínas y posibilidades de utilización.

La expresión recombinante de DNA proporciona un sistema de producción ilimitada de proteínas altamente homogéneas cuya presencia en la naturaleza sea escasa o, en todo caso, su aislamiento implique dificultades. Además se pueden preparar, por mutagénesis dirigida, derivados de esas moléculas que posean propiedades de estabilidad o actividad biológica modificadas.

¿Dónde se ha desarrollado?:

Esta tecnología ha sido desarrollada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de CC. Químicas de la Universidad Complutense de Madrid. Más de siete años lleva nuestro grupo utilizando E. coli, y cerca de cuatro P. pastoris, como sistemas de expresión. Se han expresado varias proteínas alergénicas del polen de olivo de gran incidencia clínica, así como otras de la mostaza amarilla y de colza. Estos alergenos se han purificado, y el análisis de sus propiedades estructurales y funcionales ha mostrado que son equivalentes a las de las correspondientes formas producidas en la naturaleza.

Estos datos han sido publicados en revistas científicas de las áreas de bioquímica y biología molecular, biotecnología e inmunología. En la actualidad se están preparando las patentes para la producción industrial y farmacológica de algunos de esos alergenos.

[más información sobre el departamento y el grupo de investigación]

Y además:

Diseño, a partir de la secuencia completa o parcial de una proteína, de los cebadores correspondientes para la síntesis del cDNA a partir del RNA mensajero obtenido del material biológico. Elección del sistema de expresión de este cDNA, de acuerdo con las propiedades estructurales particulares de la proteína objetivo, presencia de puentes disulfuro, plegamiento, etc. Desarrollo del proceso de expresión. Aislamiento de la proteína recombinante expresada, haciendo uso de sus características fisicoquímicas: peso molecular, solubilidad, carga, hidrofobicidad, afinidad funcional. Caracterización estructural y funcional de la proteína recombinante y evaluación de su equivalencia con la forma natural de la proteína aislada de la fuente biólogica, como comprobación de su viabilidad.

Adaptación de estos sistemas a las necesidades del cliente, esto es, diseñar los protocolos para el aislamiento de la proteína de acuerdo con los requerimientos de calidad o cantidad que nos sean informados. Producción, por mutagénesis, de derivados análogos a la proteína natural que respondan a necesidades concretas del cliente. Posibilidad de asesoramiento para la incorporación de la metodología a la empresa contratante.