Complutecno: Medicina

DETECCIÓN DE MECANISMOS PRODUCTORES DE FISURA PALATINA

Descripción:

Estudio in vivo o in vitro del paladar de embriones de ratón (o ave), a fin de determinar modificaciones sobre los procesos de adhesión y fusión del paladar bajo distintas condiciones. La detección de alteraciones se efectúa mediante técnicas de inmunohistoquímica, marcadores e hibridación in situ.

Fig. 1: (a) Cultivo de 4 días de procesos palatinos de ratón de 13 días de gestación. Las flechas indican células marcadas con el vector retroviral CXL en la línea de fusión. (b) La sección histológica muestra que se ha producido fusión y que las células han sufrido la normal transformación epitelio-mesenquimatosa (flechas).

¿Cómo funciona?:

Cultivamos procesos palatinos de embriones de ratón de 13-14 días de gestación (cultivo Trowell) o de pollo de estadio 35 HH (cultivo en agar). Se extraen los procesos palatinos microquirúrgicamente en condiciones estériles y se sitúan, apuestos (para permitir su adhesión/fusión), bien sobre filtros de Millipore en placas de cultivo con pocillo central, sobre soporte de rejilla metálica, si proceden de embriones de ratón, bien introducidos en agar, si proceden de embriones de pollo. La utilización de procesos palatinos de pollo es interesante para testar la inducción de adhesión/fusión del paladar por diferentes agentes, pues el paladar de las aves no se fusiona en condiciones normales, ni in vivo ni in vitro.

Se investigan los mecanismos celulares implicados en la fusión del paladar (adhesión de los procesos, apoptosis, transformación epitelio-mesenquimatosa, emigración celular) tanto en los cultivos tratados como en embriones hijos de animales tratados. Las técnicas utilizadas son técnicas de inmunohistoquímica, marcaje con vector retroviral CXL y marcadores lipofílicos. La visualización se realiza mediante microscopía óptica y confocal. Realizamos también hibridaciones in situ, tanto in toto como en secciones, a fin de conocer cambios de expresión genética ocurridos como resultado de los tratamientos realizados.

Fig. 2: Inmunomarcaje con anti-b-actina (a), anti-vinculina (b) y TÚNEL (c) de procesos palatinos de ratón de 14.5 días de gestación (momento en que se inicia la fusión del paladar). (a) y (b) detectan determinadas alteraciones de la adhesión normal y (c) del mecanismo de muerte celular que ocurre normalmente durante la fusión del paladar.

Ventajas:

El sistema permite comprobar la acción sobre la fusión del paladar de agentes teratógenos o terapeúticos (si se realiza en animales que presenten fisura palatina congénita: mutantes, tratados). El equipo mantiene una colonia de ratones heterocigotos para TGF-b₃, entre cuya progenie están ratones TGF-b₃ homocigotos negativos, los cuales presentan fisura palatina congénita al nacimiento y mueren. Este modelo permite ensayar, tanto in vivo como in vitro, tratamientos preventivosde la producción de fisura palatina.

Fig. 3: Cultivo de 12 horas de proceso palatino de pollo sin tratar (a) y tratado (b) con TGF-b₃. Este tratamiento induce la expresión de condroitín sulfato proteoglicano, implicado en la adhesión de los precesospalatinos. (c) Fisura palatina presentada por los ratones TGF-b₃ knockout.

¿Dónde se ha desarrollado?:

El equipo lleva trabajando en el desarrollo y puesta a punto de estas técnicas desde 1995. Estos estudios se realizan en los siguientes centros/departamentos:

• Departamento de Ciencias Morfológicas I de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense de Madrid: técnicas histológicas convencionales, de inmunohistoquímica y de hibridación in situ.
• Centro de Apoyo a la Investigación (CAI) de Técnicas Inmunológicas (Facultad de Medicina, Universidad Complutense): realización por el equipo de cultivos organotípicos, marcajes de procesos palatinos y PCR de los animales de la colonia.
• Centro de Apoyo a la Investigación (CAI) de Citometría de Flujo y Microscopía Confocal (Facultad de Farmacia, Universidad Complutense): microscopía confocal.

[más información sobre el departamento y el grupo de investigación]

Y además:

Se pueden determinar las causas de alteraciones producidas en la fusión del paladar en animales:

• Modificados genéticamente.
• Tratados con agentes teratógenos.
• Fisurados tratados con agentes profilácticos / terapéuticos.

El equipo está compuesto por médicos y biólogos con experiencia y alta dedicación a estas investigaciones.