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1.-
Una nueva estrategia
para el an�lisis de la interacci�n Candida- Macr�fago. Estudio gen�mico
y prote�mico
2.-
An�lisis gen�mico y prote�mico de la
respuesta a estr�s sobre la pared celular
3.-
A proteomic approach to Candida albicans
biofilms
4.-
Estudio del proteoma de la pared celular de Candida albicans.
Aplicaciones al estudio de dianas de antif�ngicos y al desarrollo de estrategias de diagn�stico e
inmunoprotecci�n
5.-
Prote�mica y fosfoprote�mica de la interacci�n Candida
albicans-Macr�fago: caracterizaci�n de factores de virulencia y respuesta inmunitaria de valor en
diagn�stico y protecci�n frente a infecciones
6.-
Estudio del potencial Pat�geno de cepas de
Saccharomyces cerevisiae aisladas de suplementos diet�ticos y probi�ticos
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1.- Una nueva estrategia para el an�lisis de la interacci�n Candida- Macr�fago. Estudio gen�mico y prote�mico.
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Entidad financiadora: Fundaci�n Ram�n Areces
Proyecto: �GENOMICA FUNCIONAL, PROTE�MICA Y FARMACOGEN�TICA�
Duraci�n, desde: 2-07 2002 hasta: 2-07 2005
Investigador principal: Concha Gil |
Bloque 1. Caracterizaci�n de la respuesta de Candida albicans durante su interacci�n con el macr�fago (M F)
Objetivo 1. Estudio del perfil de expresi�n de los genes de Candida albicans utilizando DNA microarrays.
Objetivo 2. Estudio de la expresi�n diferencial de prote�nas de Candida albicans en presencia y en ausencia de M F
2.1. Prote�mica de expresi�n de distintas fracciones celulares (extractos citoplasm�ticos y fracciones proteicas de la pared celular).
2.2. Fosfoprote�mica como aproximaci�n para medir la activaci�n de las prote�nas en las distintas fracciones celulares.
2.3. Identificaci�n de las prote�nas de inter�s mediante espectrometr�a de masas
Bloque 2. Estudio gen�mico y prote�mico comparativo de la implicaci�n de la rutas de transducci�n de se�ales (MAPK) en la interacci�n Candida-Macr�fago. Estudio de los mutantes hog1 D y mkc1 D .
Objetivo 1. Gen�mica utilizando DNA microarrays
Objetivo 2. Prote�mica de extractos citoplasm�ticos utilizando el m�todo DIGE.
Bloque 3. Estudio de la activaci�n del macr�fago tras su interacci�n con Candida albicans. Prote�mica y Fosfoprote�mica.
Esta nueva aproximaci�n (gen�mica y prote�mica), de un proceso clave dentro de las infecciones por Candida albicans , como es el contacto de Candida con los macr�fagos, permitir� tener una visi�n global e integrada de los estadios iniciales del proceso infeccioso. Por un lado, la expresi�n de los mecanismos de virulencia de la levadura (en un intento de evitar el control de la respuesta inmunitaria innata), y por otro la activaci�n del macr�fago como consecuencia de dicha interacci�n. Este �ltimo evento, es de vital importancia en la resoluci�n de las candidiasis invasivas, ya que la activaci�n diferencial de esta c�lula fagoc�tica es la que va a determinar el tipo de respuesta adaptativa en el hospedador.
Hasta la fecha el �nico estudio gen�mico de levaduras en presencia de macr�fagos ha sido realizado con S. cerevisiae , un organismo modelo no Pat�geno. Adem�s, tampoco se ha realizado ning�n estudio prote�mico. La aproximaci�n que proponemos en este proyecto, nos permitir� estudiar los niveles de expresi�n de los genes (transcriptoma), y estudiar las prote�nas implicadas en la interacci�n levadura-macr�fago (prote�mica de expresi�n). Adem�s realizaremos un an�lisis sistem�tico de la fosforilaci�n de las prote�nas, una modificaci�n postraduccional muy importante para la c�lula, que regula numerosos procesos, se�alizaci�n y reacciones metab�licas (fosfoprote�mica). Este estudio permitir� un conocimiento global de los complejos sistemas de se�alizaci�n celular.
Algunas de las prote�nas de Candida implicadas en esta interacci�n, podr�an ser utilizadas como dianas selectivas potenciales para el dise�o de nuevos f�rmacos antimicrobianos. Por otra parte, el conocimiento de las prote�nas implicadas en los mecanismos de activaci�n del macr�fago podr�an ayudar en la b�squeda y dise�o de f�rmacos inmunomoduladores de la respuesta del hospedador, pudiendo favorecer as� la resoluci�n de las infecciones.
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2.- An�lisis gen�mico y prote�mico de la respuesta a estr�s sobre la pared celular
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Entidad financiadora: CICYT
Proyecto GEN 2001-4707-C08-04
Duraci�n: 2003- 2005
Investigador principal: J. Arroyo |
Objetivo general del subproyecto
In Aim 1, the profiles of extracts from biofilm organisms will be compared to that of yeast cells and germ tubes. This complements the first aim of the parent grant. In Aim 2, the examination will be extended to extracts from selected mutant strains.
This complements the third aim of the parent grant in which the mutant strains are constructed and examined for biofilm formation and global gene expression. One of the phenotypic characteristics of biofilm is reduced susceptibility to many antifungal drugs including fluconazole. In Aim 3 of this proposal, proteins from biofilm exposed to fluconazole will be compared to untreated biofilm. This aim is an extension of the parent grant. Proteins will be separated by 2D-PAGE and profiles compared to identify qualitative and quantitative differences in protein abundance. Proteins that differ between planktonic and biofilm organisms, wild type and mutant strain, or drug exposed and non-exposed will be identified by mass spectrometric methods with priority given to differences in Aim 1 profiles.
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4.- Estudio del proteoma de la pared celular de Candida albicans Aplicaciones al estudio de dianas de antif�ngicos y al desarrollo de estrategias de diagn�stico e inmunoprotecci�n.
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Entidad financiadora: CICYT, BIO2003-00030
Duraci�n, desde: Diciembre 2003 hasta: Noviembre 2006
Investigador responsable: Concha Gil |
RESUMEN
El aumento de la incidencia de las infecciones f�ngicas junto con la ausencia de antif�ngicos eficaces en su tratamiento, demanda de la sociedad un esfuerzo en la mejora del tratamiento y diagn�stico de este tipo de infecciones. Candida albicans es el hongo de mayor importancia cl�nica y un microorganismo modelo para el estudio de las infecciones f�ngicas. La pared celular de levaduras es una estructura esencial, din�mica, responsable de la forma y de la integridad celular. Al estar ausente en la c�lula animal, la pared puede ser una buena diana para el desarrollo de nuevos agentes antif�ngicos. Adem�s, al ser la parte m�s externa de la c�lula va interaccionar con el hospedador y por tanto va a tener importancia en la adhesi�n, interacci�n con el macr�fago y en la respuesta inmunitaria (humoral y celular). En este proyecto pretendemos desvelar el proteoma de la pared celular Candida albicans y estudiar la expresi�n diferencial de la prote�nas de pared durante la transici�n dim�rfica: levadura-hifa. Un conocimiento profundo de esta estructura nos permitir� determinar la importancia de algunas prote�nas como dianas de agentes antif�ngicos y como factores de virulencia.
Respecto a la interacci�n de Candida con el hu�sped queremos profundizar en dos temas de gran inter�s. Por un lado, el estudio del efecto del �xido n�trico (NO), agente oxidante liberado por los macr�fagos durante la fagocitosis, sobre Candida. Por otra parte, pretendemos identificar prote�nas inmunog�nicas de Candida con el objetivo de desarrollar un m�todo de diagnostico y dise�ar, en el futuro, estrategias de tratamiento y prevenci�n de las candidiasis sist�micas.
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5.- Prote�mica y fosfoprote�mica de la interacci�n Candida
albicans-Macr�fago: caracterizaci�n de factores de virulencia y respuesta
inmunitaria de valor en diagn�stico y protecci�n frente a infecciones
El hongo
dim�rfico Candida albicans forma parte de la microbiota del hombre,
pudiendo actuar como oportunista que causa infecciones, superficiales o
sist�micas, normalmente en enfermos con alteraciones en la respuesta
inmunitaria. La morbi-mortalidad de la candididiasis sist�mica es
significativa en enfermos en cuidados intensivos, con c�ncer o sometidos
a determinadas cirug�as. La alta mortalidad de estas infecciones se debe
a limitaciones en el arsenal de antif�ngicos disponible, la aparici�n de
resistencias a estos agentes y las limitaciones diagn�sticas. Las
repercusiones econ�micas han significado un incremento notable en la
factura hospitalaria de antif�ngicos. El avance en el conocimiento de
este Pat�geno incrementa el inter�s del desarrollo de aproximaciones
novedosas para el diagn�stico, tratamiento e inmunoprevenci�n de estas
infecciones. El avance real depende de profundizar aun m�s en el
conocimiento de la patog�nesis de las candidiasis.
La finalidad de
este Proyecto es investigar la interacci�n del Pat�geno con el
hospedador, en concreto abordando la interacci�n Candida
albicans-macr�fago, utilizando aproximaciones globales de prote�mica de
expresi�n y fosfoprote�mica. Ser� un estudio en gran escala para aportar
una informaci�n global sobre los factores de virulencia de Candida para
eludir el ataque de los macr�fagos. Tambi�n nos permitir� conocer las
estrategias del macr�fago para intentar eliminar a Candida albicans. De
esta forma, lograremos profundizar en algunas funciones esenciales de
Candida cuya inhibici�n podr�a conducir, en un futuro, al desarrollo de
nuevos agentes antif�ngicos. Otro aspecto igualmente relevante es el
estudio de las prote�nas expuestas en la superficie celular. La
identificaci�n de estas prote�nas, junto con nuestros datos previos que
indican que la respuesta inmunitaria frente a Candida presenta cierta
variabilidad, hacen aconsejable el desarrollo de un �array� de prote�nas
que podr�a suponer un gran avance en el diagn�stico de la candidiasis
sist�mica. Adem�s estudiaremos algunas prote�nas inmunog�nicas que
podr�an ser candidatas para el desarrollo de futuras vacunas o de
estrategias de
inmunoprevenci�n.
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6.- Estudio del proteoma de la
pared celular de Candida albicans Aplicaciones al estudio de
dianas de antif�ngicos y al desarrollo de estrategias de diagn�stico e
inmunoprotecci�n.
La
levadura Saccharomyces
cerevisiae, es sobretodo conocida por su papel en la elaboraci�n de
bebidas alcoh�licas y del pan. Menos conocido es su papel beneficioso
para la salud tanto por su valor nutritivo como por una serie de
propiedades biofuncionales que hacen que esta levadura, bajo la
presentaci�n de suplemento diet�tico o probi�tico, se ajuste al concepto
de ingrediente funcional. Por tanto, el consumo de c�lulas vivas de S. cerevisiae forma parte, junto
con otros ingredientes y alimentos funcionales, de una tendencia
reciente que promueve la comida saludable. Los efectos beneficiosos en
el hospedador derivados de este consumo son conocidos; sin embargo, no
se han estudiado los posibles efectos indeseables sin duda debido a que
S. cerevisiae se ha
considerado siempre un microorganismo seguro para uso alimentario. En
los �ltimos a�os, la bibliograf�a cl�nica muestra un aumento en el
n�mero de casos descritos de infecciones en humanos por S. cerevisiae, principalmente en pacientes
inmunodeprimidos, por lo que actualmente S. cerevisiae se incluye en el
grupo de �Pat�genos oportunistas emergentes�. Datos previos
(Clemons et
al., 1994)muestran que ciertos aislados cl�nicos presentan
distintos grados de virulencia in
vivo. Dichos datos fueron corroborados por nuestro grupo de trabajo
mostrando adem�s el car�cter virulento de una cepa industrial. Todas
estas consideraciones nos llevaron a plantear la presente investigaci�n
cuyo objetivo principal es estudiar si la ingesta de c�lulas vivas de S .cerevisiae, a trav�s del
consumo de suplementos diet�ticos y probi�ticos, puede ser origen de
infecci�n en humanos. Para la consecuci�n
de dicho objetivo se plantean objetivos particulares que van desde el
aislamiento de cepas de S.
cerevisiae a partir de preparados comerciales y su caracterizaci�n
molecular, pasando por el estudio de sus rasgos fenot�picos de
virulencia y patogenicidad en sistemas in vivo, hasta finalmente
abordar la b�squeda de posibles genes implicados en la virulencia. Estos
estudios mostrar�n si ciertas cepas de S. cerevisiae poseen por si mismas capacidad para desarrollar una
infecci�n independientemente de factores de riesgo del propio hospedador
y adem�s, ayudar�n a conocer en parte, los mecanismos implicados en
dicho proceso infeccioso.
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