Cursos Novedades
| ¿Qué es el ADN antiguo? | Problemática | Aplicaciones | El laboratorio | Equipo investigador |
PROBLEMÁTICA DE LOS ESTUDIOS DE ADN ANTIGUO
El ADN antiguo presenta un conjunto de características que lo diferencian del ADN extraído de muestras actuales, también denominado "ADN fresco".
1. Escasez
2. Fragmentación
3. Modificaciones moleculares
La contaminación con ADN de origen diferente a la muestra es consecuencia de las tres citadas características del ADN antiguo. Comparado con el ADN fresco, recuperado de muestras actuales, el ADN antiguo presenta una "baja calidad", de manera que en presencia de ambos tipos de moléculas, se producirá la amplificación preferente del primero de los dos tipos.
Adicionalmente, algunos de los extractos de ADN antiguo, pueden contener otras moléculas que inhiben la reacción de PCR y que han pasado a ser conocidas bajo el nombre genérico de "inhibidores". Esta denominación agrupa un conjunto de moléculas de naturaleza diversa, que no tiene por qué ser la misma en todos los extractos. En cuanto a la procedencia u origen de dichos inhibidores, se ha propuesto que puede tratarse:
a. de compuestos del suelo: ácidos húmicos y/o fúlvicos, residuos de porfirinas y/o productos de su degradación y taninos entre otros.
b. de subproductos de degradación orgánica: productos de Maillard, productos de degradación del propio ADN...
Estructura química del ácido fúlvico y de una porfirina.
Contaminación con ADN exógeno
La contaminación con ADN de origen diferente a la muestra es consecuencia de las cuatro citadas características del ADN antiguo. Comparado con el ADN fresco, recuperado de muestras actuales, el ADN antiguo presenta una "baja calidad", de manera que en presencia de ambos tipos de moléculas, se producirá la amplificación preferente del primero de los dos tipos.
Esta problemática se puso de manifiesto ya en los primeros trabajos de ADN antiguo. Sin embargo, con el desarrollo de la PCR, el riesgo de contaminación se vio incrementado dada la elevada sensibilidad de dicha técnica.
Fases de riesgo
Hay cinco momentos en los que puede producirse la contaminación de la muestra con ADN exógeno:
- Durante la deposición del resto, por traspaso de ADN entre organismos próximos.
- Durante la excavación por el personal arqueológico.
- Durante el depósito en un museo por el personal encargado de la conservación.
- Durante el análisis genético en el laboratorio por el personal investigador o por material genético extraído y/o amplificado con anterioridad en el mismo lugar.
Durante la deposición puede producirse contaminación por ADN de microorganismos, hongos y fauna putrefactiva. En caso de enterramientos colectivos puede producirse también, al menos teóricamente, un traspaso de ADN de un espécimen a otro si existe mucha proximidad entre ellos. La contaminación con ADN de organismos de una especie diferente a la que se pretende estudiar no tiene por qué representar un gran problema si la región a caracterizar está lo suficientemente diferenciada a nivel de especie. La contaminación con ADN de la misma especie durante este período puede resultar o no problemática dependiendo del objetivo final del estudio. Si se desea realizar un estudio poblacional o caracterizar a una especie extinta la existencia de traspaso de información entre especímenes próximos no tiene por qué alterar las conclusiones, siempre y cuando exista contemporaneidad entre éstos. Ahora bien, si lo que se pretende es establecer relaciones de parentesco entre individuos de un mismo enterramiento esta posibilidad sí que debe de ser tenida en cuenta.
La principal fuente de contaminación en los estadios siguientes a la deposición es el ADN actual de origen humano. Este ADN puede contaminar el resto antes, durante y después del aislamiento de su material genético en el laboratorio. El ADN contaminante puede introducirse directamente en la muestra mientras ésta es manipulada por los arqueólogos, el personal del museo o los propios investigadores, por ejemplo, a través de la descamación de la piel o de los aerosoles de la respiración. Otros vehículos de contaminación pueden ser el material y reactivos empleados para su análisis genético. En este caso, la fuente de contaminación más común son los propios investigadores. Pero, en el laboratorio, durante las fases de extracción y amplificación, puede darse también contaminación por otras fuentes mucho más difíciles de detectar y erradicar: el ADN extraído con anterioridad y los amplicones de anteriores experimentos. Estos contaminantes pueden flotar en forma de aerosoles en el ambiente, o quedar adheridos tras una amplificación y/o extracción a las superficies o al material de trabajo no desechable. Este tipo de contaminación se conoce comúnmente con el nombre de “contaminación de arrastre” o “carry over”.
CRITERIOS DE AUTENTICIDAD
Desde los inicios de la disciplina del DNA antiguo se han sugerido un conjunto de criterios y medidas metodológicas para tratar de probar la autenticidad de la información genética recuperada. La necesidad de autentificar los resultados obtenidos se hizo patente a mediados de los años 90, cuando se concluyó que un conjunto de estudios eran irreproducibles. En los años siguientes, numerosos expertos introdujeron paulatinamente una serie de recomendaciones con el objeto de garantizar la autenticidad de los resultados obtenidos. Dichos consejos fueron rápidamente asimilados por las revistas científicas de impacto, que, a partir de entonces, exigen la aplicación de los mencionados criterios como requisito de aceptación y publicación de los resultados obtenidos.
Los principales criterios de autenticidad, según la revisión de PÄÄBO y colaboradores (2004) son los siguientes:
1. Análisis en un laboratorio exclusivo de ADN antiguo.
Mediante este procedimiento se pretende eliminar el DNA actual extraído, como fuente de contaminación.
2. Separación de las áreas de trabajo pre-PCR y post-PCR.
Algunos autores (BÉRAUD-COLOMB y col. 1997) recomiendan el empleo de tres habitaciones separadas: la primera para la preparación de la muestra y la extracción del ADN, la segunda para la preparación de las reacciones de PCR y la tercera para la amplificación propiamente dicha, en un termociclador dedicado exclusivamente a DNA antiguo.
Resulta recomendable además que las áreas dedicadas a la extracción y amplificación de DNA antiguo estén dotadas de un fluorescente de luz UV, accionable desde el exterior, para esterilizar la zona antes y después de cada experimento. Igualmente, se ha propuesto que la habitación destinada a la amplificación tenga presión positiva en su interior y filtros HEPA.
3. Empleo de instrumental y equipamiento exclusivo.
Este criterio engloba ciertas medidas de rutina a emplear cuando se trabaja con ADN antiguo, como por ejemplo: uso de soluciones estériles de fábrica y de puntas de pipeta con filtro, limpieza del material reciclable con o DNAsa e irradiado posterior con luz UV, manipulación de las muestras con guantes y empleo de mascarilla facial y de redecillas para el pelo por parte del personal investigador.
4. Eliminación de la capa superficial de la muestra.
5. Análisis por un único investigador.
6. Procesado en paralelo de "blancos" de extracción y amplificación.
Dichos controles contienen todos los reactivos excepto el DNA de la muestra, de manera que cualquier resultado positivo de amplificación en los mismos es indicador de la introducción de ADN contaminante durante el proceso experimental.
7. Empleo de diferentes cebadores para amplificar el mismo fragmento.
8. Correlación inversa entre el tamaño del amplicón y la intensidad del producto de amplificación visualizado en un gel de agarosa.
En aquellos casos en los que la eficiencia de amplificación de los fragmentos más pequeños es similar a la de los fragmentos de mayor tamaño el ADN no suele ser endógeno.
9. Sentido filogenético:
-en muestras no humanas: que las secuencias obtenidas sean similares a la de otros miembros de la misma especie o a especies próximas.
-en muestras humanas: comparación de las secuencias obtenidas con las de los investigadores/arqueólogos/antropólogos.
10. Realización de varias extracciones de un mismo espécimen y de diversas amplificaciones de un mismo extracto.
Este criterio permite detectar la contaminación de una extracción y/o amplificación particular así como la presencia de modificaciones químicas en el DNA endógeno. Por otra parte, el análisis de diferentes extractos aumenta la probabilidad de amplificación de secuencias endógenas cuando el resto analizado contiene una baja cantidad de DNA.
11. Replicación de todo el proceso experimental en un laboratorio independiente.
Con ello se pretende eliminar la posibilidad de contaminación procedente del propio laboratorio no detectada en los blancos.
12. Ensayos bioquímicos de preservación de otras moléculas de la muestra.
Su objeto es establecer si estado de preservación general del fósil es lo suficientemente bueno como para permitir la preservación de su material genético. El procedimiento más generalizado es el análisis de los aminoácidos de las proteínas (contenido total y grado de racemización).
13. Cuantificación del número de moléculas de DNA molde en los extractos.
Este criterio permite evaluar la probabilidad de que las mutaciones observadas en las secuencias sean consecuencia de modificaciones oxidativas post-mortem del ADN original. Generalmente, cuando el número de moléculas de DNA originales supera el millar la probabilidad de que se produzca este fenómeno es muy reducida.
14. Clonación bacteriana de los productos de amplificación y secuenciación de múltiples clones.
Esta técnica permite detectar cualquier heterogeneidad presente en los productos de amplificación e identificar la fuente de la misma: contaminación, modificaciones molecular y/o errores de la polimerasa.
